「細胞幹母」藉以創造各種動物的工具


我們都來自哪裏？「Stammbaum」與「Stammzelle」

創造今天世界上形形色色、精彩絕倫的動物生命形式時，所需要的是什麼？人類之所以成為人類的關鍵步驟是什麼？我們的根源在哪裏？這些問題迷倒了科學家、醫生、哲學家、學者等衆多人士。英國著名博物學家達爾文 (Charles Darwin) 改變了我們對自然歷史的思考方法。他提出了一種具條理的生命進化理論：在每一個物種的每一代族群裏，都會存在某些變異，當中一些變異或許是正面的，另外一些則可能是負面的。由於有這些變異，族群中的某些成員會比另外一些成員更加容易生存，並且能夠更有效地繁殖後代。久而久之，這種最能夠切合特定環境的個體的自然選擇過程便會導致演化出新的生命形式和物種。德國生物學家、藝術家兼哲學家海克爾 (Ernst Haeckel) (1834-1919) 對達爾文的思想深為折服之餘，更進一步發展和普及了進化論這個概念，可是，這個概念卻遭到了當時社會各界的堅決反對。同一時期，德國的威瑪公爵思想開放，而且是多種藝術和科學事業的贊助人，更吸引了席勒 (Friedrich Schiller) 和歌德 (Johann Wolfgang Goethe) 等人物。海克爾就是在威瑪公爵的支持下，在耶拿大學城工作（圖 1）。海克爾採用在德文裏稱為「Stammbaum」的家譜樹或系統進化樹的方式來闡述生命的歷史（Stamm：即是莖或動物門的意思）。根據這個概念，所有生命形式都有一個單一的主幹，然後分支出去，並各自進化成為過去和現在居於地球上多如繁星的各種動物。那麼，「Stammbaum」的根源是什麼？什麽是所有動物的共同祖先？與這個概念相關的是，海克爾提出了「生物發生律」。這個學説提出，每種生物體的發育正是反映了其進化歷史的一個快速而濃縮的版本（「胚胎的發育過程重演了原始生物進化的步驟」）。這個概念引發了所有細胞都有一個祖細胞的想法。[1, 2] 所有動物都是從單一個細胞 — 受精卵 — 發育而來。它的「種質」從一代流傳至下一代（「種質」這個概念最先源於韋斯曼 (August Weissmann)，其後人們才知道 DNA 才是遺傳訊息的載體）[3]。因此，每一種動物都可以追溯到一個單細胞受精卵，並且根據系統發育家族史，所有動物都是源於單一細胞。這個細胞是「Stammbaum」的最終種子，也是我們的共同祖先。海克爾在他的 1868 年著作《自然創造史》(Natürliche Schöpfungsgeschichte) 裏，自創了這個我們現在用來形容具有非常特殊性質的細胞的術語。他又使用了德文裏的「幹」一詞，將處於我們的個體發生的基礎位置之細胞，以及所有動物生命的共同祖先之系統發生類比稱為「Stammzelle」，也就是「幹細胞」。[3]

圖1：— 海克爾在 19 世紀創造了「幹細胞」一詞。照片中的是至今仍保存在德國耶拿的海克爾書房（ Ralf Jauch 攝）。

幹細胞是什麽？

這個詞語在現代的含義已經偏離了動物界所有細胞的高曾先祖這個原始意義。幹細胞有兩個重大特性。首先，幹細胞可以自我複製，並且無限繁衍。換句話說，一個幹細胞可以產生更多的幹細胞，基本上它是永生的。第二，當幹細胞接到指令時，可以轉變為在體內發揮特定作用的特殊細胞類型。我們可以憑幹細胞的效能來區分它們。受精卵是全能的，這表示它有能力發育成為完整的生物體，並且可以形成一個可存活的胚胎。隨著細胞分裂，它們逐漸形成具有專門功能的細胞。當發育中的胚胎植入子宮時，它包含一個球形的好像囊腫的結構，當中具有三種主要類型的細胞。其內部則包含大量的多能幹細胞，這些幹細胞可以形成所有的身體細胞，但不能形成胚胎周圍的細胞，例如胎盤。成年動物仍然有幹細胞，但這些幹細胞的效力僅限於特殊的身體組織和器官。舉例說，神經幹細胞只能形成神經系統的細胞。

幹細胞在動物演進裏發揮的作用

植物、真菌、動物都是由真核細胞組成的，並獨立發育出多細胞性。從單細胞真核生物（原生生物）到複雜的多細胞動物的轉變，在我們本身的進化史上，屬於一項破天荒的舉措。我們對具有有限數目的細胞類型的動物（例如海綿）進行的研究，以及與今天仍然存在於我們周圍的動物的單細胞親戚（例如領鞭毛蟲）進行之比較，都影響著我們對於上述轉變是如何發生之想法。單細胞生物的細胞可以暫時地改變身份，有時更會形成類似於多細胞實體的細胞聚集體。各種動物都是由特殊的細胞類型組成，這些細胞類型共同構成一個經精心安排地協同工作的單位。例如人類就有大約 200 個高度特化的細胞和一整套複雜的器官系統。它們的核心就是控制新細胞的形成之幹細胞。一些動物例如扁盤動物或海綿，其細胞種類有限，缺乏神經系統或肌肉。至於所有動物的單細胞的祖細胞是什麼樣子的，以及它需要經過哪些演化才能過渡成為我們的多細胞祖先？要檢索出這些脆弱的實體的化石記錄已近乎不可能。但是，藉著研究當今大自然在生命之樹的不同分支上使用了哪些分子工具包，便可以更好地理解和推斷出我們所起源的細胞使用了哪些分子。

生命的分子及其保護

讓我們的細胞得以發揮作用的分子機制顯示出驚人的保護水平，這有力地證明了生命具有共同的根源。遺傳密碼是普遍適用的，遺傳訊息在生命的不同領域裏的翻譯和複製方式都非常相似。找出是什麽樣的演化性創新使新的生命形式得以形成，就是理解我們的自然史的關鍵。雖然我們無法回到過去，手上也沒有化石記錄或者保存下來的數億以至數十億年前存在的生命形式的遺傳物質痕跡，但是，我們可以比較現存物種的基因，並且重建我們共同祖先可能使用過的分子工具。如果某些特定基因乃某個特定生命分支所獨有，那麼，那些特定基因便可能是引領至該個分支的演化路徑上的一個獨特發明，並且可能是其祖先物種進行演化所必需的。

原生生物變成動物的必需因素

科學家們認為，出現第一個複雜真核細胞這項重大改變事件乃在大約 20 億年之前發生。在此之後，又經歷了 10 至 15 億年的進化修補，才有第一批動物出現。看來，為了形成以植物、微生物或其他動物為食物的更為複雜的多細胞生命形式，當中所需的分子創新絕非微不足道。我們現在已知道許多動物及其單細胞近親的基因組。絲狀鞭毛蟲和領鞭毛蟲是與動物有最相近關係的單細胞水生原生生物。藉著研究它們的生命週期和它們的基因，有助我們瞭解創造動物時需要哪些飛躍。將多個細胞凑合在一起所需的基因，也就是幫助細胞進行溝通和接收訊號的因素，可能就是動物專用而動物的單細胞親戚所缺乏的主要分子工具。在動物的發育過程中打開和關閉基因，從而為細胞身份進行定義、為細胞命運對話進行編程的分子開關，也可能是動物獨有的進化創新。但是，我們越是深入地調查我們的單細胞親戚的基因庫，發現真正的動物特有基因和路徑種類就越少。從基因角度看，在動物進化之初，並沒有出現新生基因的爆發。相反，只出現了一個較小的新基因組合，而觸發第一種動物的出現之進化飛躍的生命藍圖整體變化則相對細微。

為多能幹細胞作定義的基因

在 1980 年代和 1990 年代，科學家們學習在培養皿内培養小鼠和人類胚胎裏發現的多能幹細胞，也因而掌握了所需工具，研究哪些基因和途徑是管控這種細胞狀態的維持的 [4 , 5]。科學家們還發現了是什麼觸發所有的特殊細胞（例如形成皮膚、心臟和大腦的細胞）偏離了原有的多能性。處於基因網路的核心的，是一些結合基因組 DNA 之中的特定區域、控制基因是開是關的分子開關掣。SOX2 和 OCT4 就是這些開關掣當中的兩個極為重要的版本。SOX2 是一個基因家族的一部分，這個基因家族的創始成員位於 Y 染色體上，作用是性別決定。在原子分辨率下，SOX2 蛋白乃充當一個分子楔子，負責結合和鬆開 DNA，從而開啟基因的表達 [6]。OCT4 是一種來自所謂 POU 家族的多功能模組化蛋白，可以重新排列並改變其與 DNA 結合的方式，從而可以容納更廣泛的 DNA 序列集 [7]。如果 SOX2 和 OCT4 受到突變或豐度改變的干擾，多能幹細胞將無法正常發揮作用 [8-10]。2006年，日本科學家山中伸彌得出一項突破性的發現，就是不必破壞胚胎，也都可以獲得多能幹細胞。我們可以在分化的細胞中引入並強制表達四個基因，這些基因能夠促使分化的細胞回復到多能幹細胞的胚胎狀態 [11]。毫不意外地，SOX2 和 OCT4 是這種神奇基因混合物的一部分，這個基因混合物觸發了一個恢復發育、形成我們現在所說的誘導性多能幹細胞（iPS 細胞）的程序（圖 2）。山中伸彌博士的發現引發了科學界的一場地震，許多科學家開始使用這項技術。現在，我們可以從小鼠、人類以至許多其他動物的皮膚、血液和尿液中，提取細胞，以便製造 iPS 細胞。山中伸彌博士憑著這項突破性技術，榮獲 2012 年諾貝爾獎。因為這項技術之故，使得對生物學最基本概念進行的研究激增，並提供了以一種全新方式研究人類疾病的機會，進而激發科學界針對一些最具危害性的疾病展開一系列臨床試驗。

圖2：— 顯微鏡下顯示的小鼠誘導性多能幹細胞 (iPSC) 集落，當中有多能性標記蛋白 Oct4（綠色）和 Sox2（紅色）的染色。影像由高雅博士拍攝。

我們的幹細胞裏的基因比我們想像的更古老

我們的實驗室被 iPS 技術提供的機會所深深吸引。我們對於驅使細胞身份發生變化的分子特別有興趣。我們試圖瞭解山中因子如何引導將特化細胞轉變為非特化 iPS 細胞所需的巨大變化（這種非特化 iPS 細胞能夠自我複製增殖並形成身體的所有其他細胞，甚至能夠創造出完整的小鼠）。在我們探索是什麽使得 SOX2 和 OCT4 如此獨特的過程中，我們與德國馬爾堡市馬普土壤微生物研究所 (Max Planck Institute of Terrestrial Microbiology) 的 Mathias Girbig 博士和 Georg Hochberg 博士以及英國倫敦瑪麗王后大學的 Alex de Mendoza 博士合作，著手勾畫它們的進化起源。有關的科學文獻顯示，SOX 和 POU（及其重要成員 OCT4）家族屬於動物特有的基因家族。SOX 和 POU 基因的發明是否從單細胞原生生物轉變為多細胞動物這個演化的關鍵性一步？為研究這個問題，我們接觸過曾經發表關於動物演化和動物基因庫的甚具影響力研究的 Alex de Mendoza 博士。我們想知道早期動物的 SOX 和 POU 基因是什麼樣的，以及它們是如何成為幹細胞的關鍵角色的。de Mendoza 博士再次回顧了是否只有動物具有 SOX 和 POU 的問題。最近的研究發現了一些新的原生生物物種，並且報道揭露了它們的基因序列。讓我們感到意外的是，透過進一步分析這些原生單細胞生物的基因序列，與傳統上所認為的相反，我們發現一些單細胞親戚含有與我們的 SOX2 和 OCT4 高度匹配的 SOX 和 POU 基因序列。由於它們並未在所有領鞭毛蟲或絲蟲類物種之中被發現，它們以往沒有被檢測出來。此前，只有兩種領鞭毛蟲物種被用作為科學上的模範，科學家對其進行了深入研究。無獨有偶，這兩個物種都沒有 SOX 和 POU。然而，領鞭毛蟲和絲蟲綱裏較不知名的成員似乎會產生真正的 SOX 和 POU。我們對這項發現大為振奮，並在香港大學生物醫學學院的實驗室對其進行了研究。我們想將它們的功能與多能性明星組合 SOX2 和 OCT4 進行比較。

7 億年前的 Ur-Sox 可用來製造小鼠幹細胞

我們首先合成出 SOX 和 POU 基因，然後採用有關技術來生產它們的蛋白質產物，從而檢查它們是否會結合 DNA 以及如何結合 DNA。富有才華、孜孜不倦的生物化學家 陳培文博士當時正在港大醫學院攻讀博士學位的最後階段，她毅然接受了這項挑戰。她發現，原生生物 SOX 可以牢固地結合與我們的 SOX2 相同的 DNA 序列。這就帶出了下一個問題：是否單憑這種生物化學特性，就可以讓原生生物 SOX 複製 SOX2 的功能，從而製造出 iPS 細胞？在香港大學蛋白質與細胞工程實驗室 (@pacelab) 攻讀博士學位期間已成為幹細胞生物學和複雜 iPS 技術的專家之高雅博士研究著重於這個問題。在哺乳動物中，只有 SOX2 及其最接近的家族蛋白具備製造 iPS 細胞之能力，但此外 20 多個 SOX 家族因子中的大多數都不具備這個能力。但是，高博士研究發現，令人驚訝的是，雖然領鞭毛蟲 SOX 已經獨立進化了數億年，但它仍能誘導小鼠的 iPS 細胞。驗證 iPS 細胞的多能性之試金石，是將這些細胞與小鼠胚胎混合，然後把它們植入到代孕母體之中。結果很令我們驚奇：用領鞭毛蟲 SOX 製成的 iPS 細胞能為可存活的嵌合體小鼠提供組織斑塊（圖 3）。我們的研究結果在《自然通訊》(Nature Communications) 上發表之後，這隻體内有斑塊的雌性小鼠和其無 iPS 細胞的伴侶變得有名起來，在《華盛頓郵報》、《福布斯》雜誌以至另外許多媒體上都有關於他們的報導。領鞭毛蟲 SOX 可以像我們多細胞動物的 SOX2 一樣製造 iPS 細胞。領鞭毛蟲現在就在我們的周圍，其演化歷史與我們一樣久遠。正因這樣，它們不應該被視為更加原始或更加古老。理想上，我們希望回到過去，研究過去曾經存在的分子。這正是德國馬普土壤微生物研究所的演化生物化學家 Georg Hochberg 博士和 Mathias Girbig 博士所能夠做到的。他們採用以動物和原生生物 SOX 基因序列製作的家譜樹，並使用統計模型，來推斷我們的遠古祖先裏存在哪一種 SOX 基因。藉著這個方法，他們發掘出祖先 Ur-SOX，這是所有動物的 SOX 基因的前身。高博士證明，即使是這種祖先 Ur-SOX 也能產生小鼠 iPS 細胞。屬於我們的單細胞高曾先祖的一個假設性細胞似乎包含一種 SOX 因子，該因子完全有能力釋放製造現代哺乳動物幹細胞所需的遺傳程式。這種遠古的 Ur-SOX 可能要比幹細胞本身還要老，但非常巧合的是，在進化力量組成基因網路，使幹細胞發揮作用時，它便已經存在。

圖3：— 左邊的嵌合體小鼠是由源自 7 億年前的領鞭毛蟲 SOX 基因的 iPS 細胞生成的，這隻小鼠有黑色的皮毛斑塊和黑色的眼睛。相反，右邊的野生小鼠有白色的皮毛和紅色的眼睛。照片來自 高雅博士及 Alvin Kin Shing Lee （香港大學比較醫學研究中心）。源自我們的研究論文。[12]

POU 基因的變化是否朝向動物的進化過程中的關鍵事件？

POU 基因的演化歷史更為複雜和富有動態。Alex de Mendoza 博士在較不知名的動物親戚中進行了基因搜尋，其結果也表明，這些基因應該在第一批動物在地球各處遊走之前便已經存在。但是，陳培文博士仔細地進行過生化分析，結果顯示，領鞭毛蟲 POU 與 DNA 的結合方式跟幹細胞因子 OCT4 與 DNA 的結合方式大為不同。毫不奇怪地，領鞭毛蟲 POU 不能取代 OCT4 來產生小鼠的 iPS 細胞。在朝向動物進化的道路上，POU 基因較大可能經歷了進化性適應的步驟。我們不知道那些步驟何時發生、如何發生，但是，我們推測，第一隻動物具有一種 POU 因子，這種 POU 因子結合 DNA 和管控基因的方式與領鞭毛蟲 POU 的並不相同。至於 SOX 和 POU 因子是否早已在所有動物的祖細胞中形成了密切的伙伴關係，就像 SOX2 和 OCT4 在我們的多能幹細胞中那樣，這是一個極為有趣但高度推測性的想法。如果是這樣的話，進化過程可能利用了兩個預先存在的因子，來選擇幹細胞的主要管控者。Ur-SOX 早在第一隻動物出現並且被納入這個網絡之前很久便已經準備好，而 Ur-POU 在進化成為動物的過程中需要更多的調整才能承擔這個角色。

我們能否從進化過程學習，改造幹細胞來治療疾病和延緩衰老？

瞭解生命的歷史、瞭解塑造我們周圍的世界的分子構件是如何進化過來的，這本身就十分有趣。除了尋求學術上的興趣之外，對大自然的研習結果還可以為我們提供解決人類某些負擔的工具。一段時間以來，科學家們已在實驗室裏運用進化的機制，來優化蛋白質和在功能上改變蛋白質。我們有用以強制和加快定向地或隨機地產生突變的過程之必要工具。我們可以設計嚴格的實驗，從而選擇「最適合」的蛋白質變異體來達到要求的目的。我們可以透過多次連續的重複，來做到這一點，從而在實驗室裏逐步演化出蛋白質。以這種方式創製的實驗室工程設計蛋白現已在生物科技、農業等領域裏有無數的應用，並已被用作藥物和治療補充劑。我們還可以利用設計蛋白，更快捷、更高效地將體細胞轉化為幹細胞。最近，由 OpenAI 創辦人 Sam Altmann 提供 1 億 8,000 萬美元支持的人工智能初創公司 Retro Biosciences [13] 也加入了這一行列，並且已發表了 SOX2 和 KLF4 的人工版本。他們的人工智能算法的訓練方式，是透過比較許多蛋白質序列以及學習其自然進化來進行的。他們希望利用他們的人工智能修飾蛋白，來逆轉與年齡相關的疾病。多年以來，我們的實驗室一直利用實驗室進化，來促進各種幹細胞的產生。我們相信，採用經重新設計的蛋白質，能夠幫助我們研究老化、建立疾病模型、實現物種保護，以及產生具有更高品質的幹細胞。我們可以產生能夠轉化為更多種類的組織甚至細微器官的幹細胞。我們希望學會使衰老的幹細胞產生真實的細胞，以便捕捉在年齡相關疾病裏出現的問題。我們甚或能夠利用細胞重新編程的方法，來改變我們體內細胞的身份，從而修復受損的器官。一些科學家更加抱有大膽的希望，希望我們能減緩甚至停止老化帶來的負擔。在實驗室和動物體內操縱細胞的過程中，山中因子和相關分子發揮著關鍵性角色。從進化中學習，以便回到過去，復活古老的蛋白質，並且以此作為指引，從頭開始製造全新的蛋白質，將能幫助我們優化製造我們用以研究衰老問題並最終治療不同疾病的細胞的因素。

圖 4：— 透過祖先 Ur-Sox 尋找動物進化的根源（繪圖：楊思穎）

研究論文：

Gao, Y., Tan, D. S., Girbig, M., Hu, H., Zhou, X., Xie, Q., Yeung, S. W., Lee, K. S., Ho, S. Y., Cojocaru, V., Yan, J., Hochberg, G. K. A., de Mendoza, A., & Jauch, R. (2024). The emergence of Sox and POU transcription factors predates the origins of animal stem cells. Nat Commun, 15(1), 9868. https://doi.org/10.1038/s41467-024-54152-x

參考資料︰

  1. Maehle, A.H., Ambiguous cells: the emergence of the stem cell concept in the nineteenth and twentieth centuries. Notes Rec R Soc Lond, 2011. 65(4): p. 359-78.
  2. Levit, G.S., et al., The biogenetic law and the Gastraea theory: From Ernst Haeckel's discoveries to contemporary views. J Exp Zool B Mol Dev Evol, 2022. 338(1-2): p. 13-27.
  3. Droscher, A., Images of cell trees, cell lines, and cell fates: the legacy of Ernst Haeckel and August Weismann in stem cell research. Hist Philos Life Sci, 2014. 36(2): p. 157-86.
  4. Evans, M.J. and M.H. Kaufman, Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981. 292(5819): p. 154-6.
  5. Thomson, J.A., et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998. 282(5391): p. 1145-7.
  6. Tan, D.S., et al., SOX17 in cellular reprogramming and cancer. Semin Cancer Biol, 2020. 67(Pt 1): p. 65-73.
  7. Malik, V., D. Zimmer, and R. Jauch, Diversity among POU transcription factors in chromatin recognition and cell fate reprogramming. Cell Mol Life Sci, 2018. 75(9): p. 1587-1612.
  8. Masui, S., et al., Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat Cell Biol, 2007. 9(6): p. 625-35.
  9. Tapia, N., et al., Dissecting the role of distinct OCT4-SOX2 heterodimer configurations in pluripotency. Sci Rep, 2015. 5: p. 13533.
  10. Malik, V., et al., Pluripotency reprogramming by competent and incompetent POU factors uncovers temporal dependency for Oct4 and Sox2. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 3477.
  11. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p. 663-76.
  12. Gao, Y., et al., The emergence of Sox and POU transcription factors predates the origins of animal stem cells. Nat Commun, 2024. 15(1): p. 9868.
  13. RetroBiosciences. 2025; Available from: https://www.retro.bio/.

作者：
香港大學醫學院生物醫學學院教授及幹細胞轉化研究中心首席研究員Ralf Jauch教授

鳴謝
我們衷心感謝Mathias Girbig博士、 Alex de Mendoza博士、陳培文博士、高雅博士以及 Hannah Lam 對本專題文章的寶貴意見。

2025年3 月